¿Cómo elegir las columnas de HPLC de fase inversa?
Las distintas fases enlazadas para separaciones en fase inversa presentan diferentes combinaciones de posibles interacciones soluto-fase estacionaria. En el caso de las fases enlazadas, la variedad de mecanismos de separación influirá en la selectividad global. Esta predominancia dependerá de las propiedades del analito y de las condiciones cromatográficas aplicadas. Las interacciones más significativas entre el soluto y las fases estacionarias que contribuyen a la selectividad de la columna son las siguientes.
- Interacción hidrofóbica es un mecanismo de retención dominante para todas las columnas de fase inversa y la interacción más significativa de las fases alquílicas. Para una fase determinada, el tiempo de retención es proporcional a la hidrofobicidad de la molécula.
- Capacidad de enlace de hidrógeno de una fase implica generalmente la interacción de un grupo básico del soluto con un grupo ácido dentro de la fase estacionaria, posiblemente a partir de grupos silanol no unidos.
- Interacciones π-π se observan entre un soluto aromático o insaturado y una fase estacionaria aromática.
- Selectividad estérica es una medida de la accesibilidad de los solutos a la fase estacionaria. Las moléculas de soluto más grandes pueden quedar excluidas de la fase estacionaria.
- Interacciones dipolo-dipoloentre un grupo dipolar del soluto y un grupo dipolar de la fase estacionaria son más importantes en el caso de las columnas de enlace ciano y PFP.
- Interacciones de intercambio catiónico puede producirse entre un soluto catiónico y un silanol ionizado dentro de la fase estacionaria.
A continuación se ofrece un resumen general de estas interacciones para fases enlazadas de fase inversa típicas. Pueden predominar distintas interacciones para distintos analitos y las intensidades de interacción variarán según las fases enlazadas de los distintos fabricantes. No obstante, esta tabla ofrece una indicación útil de las posibles intensidades de interacción.
Fase de enlace | Listado USP | Hidrófobo | Enlace H | π-π | Estérico | Dipolo-dipolo | Intercambio catiónico |
| C18 | L1 | Muy fuerte | Débil | No | Débil | No | Débil |
| C8 | L7 | Fuerte | Débil | No | Débil | No | Débil |
| C4 | L26 | Débil | Débil | No | Débil | No | Débil |
| Fenil | L11 | Fuerte | Débil | Donante fuerte | Moderado | Débil | Débil |
| PFP | L43 | Moderado | Moderado | Fuerte aceptor | Moderado | Fuerte | Moderado |
| Ciano | L10 | Débil | Débil | Débil | Débil | Fuerte | Débil |
Columna de fase inversa C18
La hidrofobicidad es el principal mecanismo de interacción del analito con el C18 y otras fases estacionarias con enlaces alquílicos. Además, la polaridad de la fase también contribuirá a la selectividad global observada.
Hidrofobicidad
La fuerza de la interacción hidrófoba puede medirse por la retención de moléculas neutras (no polares). Los valores k (factores de retención) de una especie neutra, para una fase C18 determinada, darán una indicación de la superficie y la cobertura superficial (densidad del ligando) de la sílice.
El porcentaje de carbono en el material es una guía simplista pero útil de las características de retención hidrófoba de una columna. En la figura 1, esta correlación imprecisa queda demostrada por el aumento de la retención observado al aumentar la longitud de la cadena alquílica (es decir, la carga de carbono). Este aumento es el resultado de un aumento de la hidrofobicidad de la fase estacionaria. Del mismo modo, se esperaría un aumento de la retención al pasar de una fase C18 con una carga de carbono baja a otra con una carga de carbono alta.
La selectividad hidrófoba puede determinarse a partir de la relación del factor de retención entre dos especies neutras. Esta es una mejor medida de la cobertura superficial que el contenido en carbono, ya que el área superficial y la porosidad pueden variar de una sílice a otra.
Polaridad
La segunda propiedad clave de los materiales C18 es su actividad de silanol, a menudo discutida en términos de polaridad. Esto puede determinarse midiendo la relación del factor de retención entre un compuesto básico y uno ácido. A un pH >7, la capacidad total de intercambio iónico corresponderá a una medida de la actividad de silanol total. A pH ácido (por ejemplo, pH 2,7) puede obtenerse una indicación de la actividad ácida de los grupos silanol. La presencia de iones metálicos en la sílice base aumenta el nivel de actividad del silanol. Las sílices de generaciones anteriores tienen niveles más elevados y menos controlados de iones metálicos y, por tanto, mayores
actividad silanol en comparación con las fases de enlace alquilo de nueva generación. Para esta
y otras razones, se recomienda encarecidamente que el desarrollo de nuevos métodos
debe abordarse utilizando sílices de mayor pureza de nueva generación.
Fases desactivadas de base de gran pureza
Las fases modernas con enlace alquilo tienen niveles acumulativos de iones metálicos muy bajos dentro de la sílice base (<10ppm), lo que hace que el número de grupos silanol aislados, y por tanto la polaridad de la superficie de sílice, también se reduzca. Combinados con procesos de enlace más eficaces y reproducibles, estos materiales de fase inversa de nueva generación permiten mejorar significativamente la cromatografía de las moléculas de soluto polares más básicas. El uso de grupos alquilo enlazados que contengan sustituyentes hidrófilos (es decir, incrustados polares) puede potenciar este efecto y/u ofrecer una selectividad alternativa.
Optimización de la selectividad
La figura 2 ilustra la relación entre el cambio de polaridad y la hidrofobicidad de los materiales típicos C18, C8 y C4, mostrando una disminución de la hidrofobicidad al reducir la longitud de la cadena alquílica. Una mayor densidad del ligando y, por tanto
menor polaridad, también se observa a medida que se reduce la longitud de la cadena alquílica. Sin embargo, cambiar la longitud de la cadena alquílica puede reducir el tiempo de análisis, pero no afectará significativamente a la selectividad. El cambio de la química a una fase enlazada alternativa es una herramienta más potente para conseguirlo.
Generación de más edad Fases "tradicionales
Las fases C18 "tradicionales" más antiguas son hidrófobas y tienen una alta polaridad debido a que la sílice de menor pureza contiene un mayor nivel de grupos silanol ácidos en los que se basan. El uso de las nuevas sílices de alta pureza reduce la actividad de silanol de las fases resultantes y mejora la reproducibilidad. El empleo de una funcionalidad polar incrustada también puede dar lugar a un material de polaridad reducida. Para solutos básicos que interaccionarán fuertemente con los silanoles superficiales, se recomiendan generalmente fases de polaridad más baja. Sin embargo, para determinados análisis, las interacciones adicionales proporcionadas por los silanoles superficiales de un material C18 "tradicional" pueden ser beneficiosas para la separación global.
Columna de fase inversa de fenilo
Las fases de sílice con enlaces fenílicos ofrecen una selectividad en fase inversa alternativa a las fases con enlaces alquílicos. Muestran una menor retención hidrófoba que sus homólogas C18, con características de retención similares a las fases con enlace C8. Las fases estacionarias fenílicas interactúan con compuestos que contienen grupos aromáticos o enlaces insaturados mediante la participación de interacciones π-π. En el caso de solutos aromáticos que contengan un átomo o grupo electronegativo (por ejemplo, F, NO2), aumentará el grado de interacciones π-π con la fase fenílica.
Debido a la naturaleza rígida del anillo fenilo, la forma del soluto también puede influir en la selectividad.
Las fases de fenilo tradicionales tienden a ser menos estables que las correspondientes fases invertidas C8 o C18. Además, el mayor tamaño estérico del grupo fenilo reduce la cobertura de la superficie, dejando un mayor número de sitios de silanol expuestos. Las fases de fenilo introducidas más recientemente muestran una mayor estabilidad. El uso de una base de sílice más pura, unos procedimientos de unión más eficaces y reproducibles y la disponibilidad de un fenil silano estéricamente protegido contribuyen a una mayor robustez de la fase y a una reducción del sangrado de la columna.
Las fases de fenilo convencionales se unen a la sílice a través de un espaciador de propilo. La incorporación del espaciador de hexilo de cadena más larga da lugar a una mayor retención hidrófoba y selectividad aromática.
Fases de sílice de enlace polar
Las fases de sílice con enlaces polares ofrecen una selectividad alternativa a los materiales con enlaces alquílicos. En general, tienen menor hidrofobicidad pero mayor polaridad. Las fases de enlace ciano, amino y diol pueden utilizarse tanto en fase normal como en fase inversa. En fase normal, se equilibran más rápidamente con el eluyente que la propia sílice y no se desactivan por trazas de agua.
Las fases de enlace ciano presentan una selectividad única para compuestos polares y son más adecuadas que la sílice desnuda para separaciones en gradiente de fase normal. El grupo funcional ciano es un dipolo fuerte que puede interactuar con otros dipolos o inducir dipolos en los solutos. Estas fases también presentan una hidrofobicidad moderada debido al enlazador alquilo.
Las fases con enlace amino presentan una selectividad en fase normal alternativa a la de la sílice sin enlace, especialmente para aromáticos. Las columnas amino también se utilizan en el modo HILIC para el análisis de hidratos de carbono y otros compuestos polares. Sus propiedades de intercambio aniónico débil pueden utilizarse en el análisis de aniones y ácidos orgánicos.
Las fases enlazadas con diol son una alternativa versátil a la sílice no enlazada para separaciones en fase normal. Los grupos hidroxilo proporcionan una buena selectividad sin una retención excesiva, ya que el enlace H con la capa de diol es más débil que con los silanoles. Algunas fases enlazadas con diol se han desarrollado específicamente para aplicaciones HILIC. En las separaciones por exclusión de tamaño se utilizan materiales con tamaños de poro diferentes.
Columnas de fase inversa y graneles Biovanix
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