Как выбрать колонки для ВЭЖХ с обращенной фазой?
Различные связанные фазы для обращенно-фазового разделения демонстрируют различные комбинации возможных взаимодействий растворитель-стационарная фаза. Для связанной фазы разнообразие механизмов разделения влияет на общую селективность. Это преобладание зависит от свойств аналита и применяемых хроматографических условий. Ниже приведены наиболее значимые взаимодействия между растворителем и стационарной фазой, которые влияют на селективность колонки.
- Гидрофобное взаимодействие является доминирующим механизмом удерживания для всех обращенно-фазовых колонок и наиболее значимым взаимодействием алкильных фаз. Для данной фазы время удерживания пропорционально гидрофобности молекулы.
- Способность к водородному связыванию фазы обычно включает в себя взаимодействие основной группы растворителя с кислотной группой в стационарной фазе, возможно, с несвязанными силанольными группами.
- π-π взаимодействия наблюдаются между ароматическим или ненасыщенным растворителем и ароматической неподвижной фазой.
- Стерическая селективность является мерой доступности растворителей для стационарной фазы. Более крупные молекулы растворителя могут быть исключены из стационарной фазы.
- Диполь-дипольные взаимодействияМежду диполярной группой растворителя и диполярной группой в неподвижной фазе наиболее важны в случае колонок с циано и ПФП связями.
- Катионообменные взаимодействия может происходить между катионным растворителем и ионизированным силанолом в неподвижной фазе.
Ниже приводится общее описание этих взаимодействий для типичных обращенно-фазовых связанных фаз. Для разных аналитов могут преобладать разные взаимодействия, а интенсивность взаимодействия между связанными фазами разных производителей может отличаться. Тем не менее, эта таблица дает полезное представление о вероятных силах взаимодействия.
Облигатная фаза | Перечень УТП | Гидрофобный | H-связь | π-π | Стерические | Диполь-диполь | Катионообменные |
| C18 | L1 | Очень сильный | Слабый | Нет | Слабый | Нет | Слабый |
| C8 | L7 | Сильный | Слабый | Нет | Слабый | Нет | Слабый |
| C4 | L26 | Слабый | Слабый | Нет | Слабый | Нет | Слабый |
| Фенил | L11 | Сильный | Слабый | Сильный донор | Умеренный | Слабый | Слабый |
| PFP | L43 | Умеренный | Умеренный | Сильный акцептор | Умеренный | Сильный | Умеренный |
| Cyano | L10 | Слабый | Слабый | Слабый | Слабый | Сильный | Слабый |
Обращенно-фазовая колонка C18
Гидрофобность является основным механизмом взаимодействия аналита с C18 и другими алкил-связанными стационарными фазами. Кроме того, полярность фазы также вносит свой вклад в общую селективность.
Гидрофобность
Сила гидрофобного взаимодействия может быть измерена по удержанию нейтральных (неполярных) молекул. Значения k (коэффициентов удерживания) для нейтральных видов для данной фазы C18 дают представление о площади поверхности и поверхностном покрытии (плотности лигандов) кремнезема.
Процентное содержание углерода в материале является упрощенным, но полезным показателем гидрофобных характеристик удерживания колонки. На рисунке 1 эта свободная корреляция продемонстрирована увеличением удерживания, наблюдаемым при увеличении длины алкильной цепи (т.е. углеродной нагрузки). Это увеличение происходит в результате повышения гидрофобности неподвижной фазы. Аналогично, увеличение удерживания можно ожидать при переходе от фазы C18 с низким содержанием углерода к фазе с высоким содержанием углерода.
Гидрофобная селективность может быть определена по соотношению коэффициентов удерживания между двумя нейтральными видами. Это более точная мера покрытия поверхности, чем содержание углерода, поскольку площадь поверхности и пористость могут варьироваться от кремнезема к кремнезему.
Полярность
Вторым ключевым свойством материалов C18 является их силанольная активность, которая часто обсуждается в терминах полярности. Ее можно определить, измерив соотношение коэффициента удерживания между основным и кислотным соединением. При pH >7 общая ионообменная емкость будет соответствовать показателю общей силанольной активности. При кислом pH (например, pH 2,7) можно судить о кислотной активности силанольных групп. Присутствие ионов металлов в основном кремнеземе повышает уровень силанольной активности. Силикаты старого поколения имеют более высокие и менее жестко контролируемые уровни ионов металлов, и, следовательно, более высокую
Силанольная активность по сравнению с алкилсвязанными фазами нового поколения. Для этого
и по другим причинам, настоятельно рекомендуется разрабатывать новые методы
следует подходить с использованием силикатов более высокой чистоты нового поколения.
Деактивированные фазы на основе высокочистого основания
Современные фазы с алкильными связями имеют очень низкий суммарный уровень ионов металлов в основном кремнеземе (<10ppm), что приводит к уменьшению количества изолированных силанольных групп, а значит, и полярности поверхности кремнезема. В сочетании с более эффективными и воспроизводимыми процессами связывания эти обращенно-фазовые материалы нового поколения позволяют значительно улучшить хроматографию для более основных полярных молекул растворителей. Использование связанных алкильных групп, содержащих гидрофильные заместители (т.е. полярные встроенные), может либо усилить этот эффект, либо обеспечить альтернативную селективность.
Оптимизация селективности
На рис. 2 показана зависимость между изменением полярности и гидрофобностью для типичных материалов C18, C8 и C4, демонстрирующая снижение гидрофобности при уменьшении длины алкильной цепи. Большая плотность лигандов и, следовательно,
Более низкая полярность также наблюдается при уменьшении длины алкильной цепи. Однако изменение длины алкильной цепи может сократить время анализа, но не окажет существенного влияния на селективность. Изменение химического состава на альтернативную связанную фазу - более мощный инструмент для достижения этой цели.
Старшее поколение "Традиционные" фазы
Старые "традиционные" фазы C18 гидрофобны и обладают высокой полярностью из-за того, что кремнезем низкой степени очистки содержит более высокий уровень кислотных силанольных групп, на которых они основаны. Использование новых кремнеземов высокой степени очистки снижает силанольную активность получаемых фаз и улучшает воспроизводимость. Использование полярной встроенной функциональности также может привести к получению материала с пониженной полярностью. Для основных растворителей, которые будут сильно взаимодействовать с поверхностными силанолами, обычно рекомендуются фазы с более низкой полярностью. Однако для некоторых анализов дополнительные взаимодействия, обеспечиваемые поверхностными силанолами "традиционного" материала C18, могут оказаться полезными для общего разделения.
Фениловая обращенно-фазовая колонка
Фенилсвязанные кремнеземные фазы обеспечивают селективность обращенной фазы, альтернативную алкилсвязанным фазам. Они демонстрируют более низкое гидрофобное удерживание, чем их C18-аналоги, при схожих характеристиках удерживания с C8-связанными фазами. Фениловые стационарные фазы взаимодействуют с соединениями, содержащими ароматические группы или ненасыщенные связи, посредством π-π взаимодействий. Для ароматических растворителей, содержащих электроотрицательный атом или группу (например, F, NO2), степень π-π взаимодействия с фенильной фазой увеличивается.
Из-за жесткой природы фенильного кольца форма растворителя также может влиять на селективность.
Традиционные фенильные фазы, как правило, менее стабильны, чем соответствующие обращенные фазы C8 или C18. Кроме того, больший стерический размер фенильной группы уменьшает покрытие поверхности, оставляя большее количество открытых силанольных участков. Недавно появившиеся фенильные фазы демонстрируют большую стабильность. Использование более чистой кремнеземной основы, более эффективные и воспроизводимые процедуры связывания и наличие стерически защищенного фенил-силана - все это способствует повышению прочности фаз и уменьшению кровотечения в колонках.
Обычные фенильные фазы соединены с кремнеземом через пропиловый спейсер. Включение более длинноцепочечного гексилового спейсера приводит к увеличению гидрофобного удержания и ароматической селективности.
Полярно-связанные фазы кремнезема
Кремнеземные фазы с полярными связями обладают селективностью, альтернативной алкильным связям. Как правило, они обладают меньшей гидрофобностью, но большей полярностью. Фазы с циано-, амино- и диольной связью могут использоваться как в нормально-, так и в обращенно-фазовом режимах. В нормальной фазе они быстрее уравновешиваются с элюентом, чем сам кремнезем, и не дезактивируются следами воды.
Цианосвязанные фазы демонстрируют уникальную селективность для полярных соединений и более пригодны для градиентного разделения в нормальной фазе, чем голый диоксид кремния. Цианофункциональная группа является сильным диполем, который может взаимодействовать с другими диполями или индуцировать диполи на растворителях. Эти фазы также обладают умеренной гидрофобностью благодаря алкильному линкеру.
Аминосвязанные фазы демонстрируют селективность, отличную от селективности обычной фазы, особенно для ароматических соединений. Амино-колонки также используются в режиме HILIC для анализа углеводов и других полярных соединений. Их слабые анионообменные свойства могут быть использованы для анализа анионов и органических кислот.
Фазы с диоловой связью являются универсальной альтернативой кремнезему без связи для разделения на нормальных фазах. Гидроксильные группы обеспечивают хорошую селективность без чрезмерного удерживания, поскольку Н-связь с диоловым слоем слабее, чем с силанолом. Некоторые фазы с диольными связями были разработаны специально для применения в HILIC. Материалы с разным размером пор используются для разделения методом исключения размеров.
Обращенно-фазовые колонки и наливы Biovanix
Есть проблемы с жидкостной хроматографией? Свяжитесь с нами напрямую.
EN 
AR 
FR 
DE 
KO 
RU 
ES 