Wie wählt man Umkehrphasen-HPLC-Säulen aus?
Verschiedene gebundene Phasen für Umkehrphasen-Trennungen weisen unterschiedliche Kombinationen möglicher Wechselwirkungen zwischen gelöster und stationärer Phase auf. Bei gebundenen Phasen beeinflusst die Vielfalt der Trennmechanismen die Gesamtselektivität. Diese Vorherrschaft hängt von den Eigenschaften des Analyten und den angewandten chromatographischen Bedingungen ab. Die wichtigsten Wechselwirkungen zwischen gelösten Stoffen und stationären Phasen, die zur Selektivität der Säule beitragen, sind die folgenden.
- Hydrophobe Wechselwirkung ist ein dominanter Retentionsmechanismus für alle Umkehrphasensäulen und die wichtigste Wechselwirkung von Alkylphasen. Für eine bestimmte Phase ist die Retentionszeit proportional zur Hydrophobizität des Moleküls.
- Wasserstoff-Bindungsfähigkeit einer Phase beinhaltet im Allgemeinen die Wechselwirkung einer basischen Gruppe des gelösten Stoffes mit einer sauren Gruppe innerhalb der stationären Phase, möglicherweise durch ungebundene Silanolgruppen.
- π-π-Wechselwirkungen zwischen einem aromatischen oder ungesättigten gelösten Stoff und einer aromatischen stationären Phase beobachtet werden.
- Sterische Selektivität ist ein Maß für die Zugänglichkeit der gelösten Stoffe für die stationäre Phase. Größere gelöste Moleküle können von der stationären Phase ausgeschlossen werden.
- Dipol-Dipol-Wechselwirkungenzwischen einer dipolaren gelösten Gruppe und einer dipolaren Gruppe in der stationären Phase sind im Falle von Cyano- und PFP-gebundenen Säulen am wichtigsten.
- Kationen-Austausch-Wechselwirkungen zwischen einem kationischen gelösten Stoff und einem ionisierten Silanol in der stationären Phase auftreten kann.
Nachfolgend finden Sie eine allgemeine Zusammenfassung dieser Wechselwirkungen für typische Umkehrphasenbindungen. Bei verschiedenen Analyten können unterschiedliche Wechselwirkungen vorherrschen, und die Wechselwirkungsstärken variieren zwischen den gebundenen Phasen der verschiedenen Hersteller. Diese Tabelle gibt jedoch einen nützlichen Hinweis auf wahrscheinliche Wechselwirkungsstärken.
Gebundene Phase | USP-Auflistung | Hydrophobie | H-Bindung | π-π | Sterisch | Dipol-Dipol | Kationen-Austausch |
| C18 | L1 | Sehr stark | Schwach | Nein | Schwach | Nein | Schwach |
| C8 | L7 | Stark | Schwach | Nein | Schwach | Nein | Schwach |
| C4 | L26 | Schwach | Schwach | Nein | Schwach | Nein | Schwach |
| Phenyl | L11 | Stark | Schwach | Starker Geber | Mäßig | Schwach | Schwach |
| PFP | L43 | Mäßig | Mäßig | Starker Akzeptor | Mäßig | Stark | Mäßig |
| Cyano | L10 | Schwach | Schwach | Schwach | Schwach | Stark | Schwach |
C18 Umkehrphasen-Säule
Die Hydrophobie ist der wichtigste Mechanismus für die Wechselwirkung des Analyten mit C18 und anderen alkylgebundenen stationären Phasen. Darüber hinaus trägt auch die Polarität der Phase zur beobachteten Gesamtselektivität bei.
Hydrophobie
Die Stärke der hydrophoben Wechselwirkung kann anhand der Retention von neutralen (unpolaren) Molekülen gemessen werden. Die k-Werte (Retentionsfaktoren) für eine neutrale Spezies für eine bestimmte C18-Phase geben einen Hinweis auf die Oberfläche und die Oberflächenbedeckung (Ligandendichte) des Silicas.
Der prozentuale Anteil des Kohlenstoffs im Material ist ein einfacher, aber nützlicher Anhaltspunkt für die hydrophoben Retentionseigenschaften einer Säule. In Abbildung 1 wird diese lockere Korrelation durch die Zunahme der Retention deutlich, die beobachtet wird, wenn die Alkylkettenlänge (d. h. die Kohlenstoffmenge) erhöht wird. Dieser Anstieg resultiert aus einer Zunahme der Hydrophobie der stationären Phase. In ähnlicher Weise wäre eine Zunahme der Retention zu erwarten, wenn man von einer C18-Phase mit geringer Kohlenstoffbelastung zu einer mit hoher Kohlenstoffbelastung übergeht.
Die hydrophobe Selektivität lässt sich anhand des Verhältnisses der Retentionsfaktoren zwischen zwei neutralen Spezies bestimmen. Dies ist ein besseres Maß für die Oberflächenbedeckung als für den Kohlenstoffgehalt, da Oberfläche und Porosität von Kieselsäure zu Kieselsäure variieren können.
Polarität
Die zweite Schlüsseleigenschaft von C18-Materialien ist ihre Silanolaktivität, die oft als Polarität bezeichnet wird. Diese kann durch Messung des Retentionsfaktorverhältnisses zwischen einer basischen und einer sauren Verbindung bestimmt werden. Bei einem pH-Wert >7 entspricht die gesamte Ionenaustauschkapazität einem Maß für die gesamte Silanolaktivität. Bei einem sauren pH-Wert (z. B. pH 2,7) kann ein Hinweis auf die saure Aktivität der Silanolgruppen erhalten werden. Das Vorhandensein von Metallionen in der basischen Kieselsäure erhöht den Grad der Silanolaktivität. Siliciumdioxid der älteren Generation hat einen höheren und weniger streng kontrollierten Gehalt an Metallionen und damit eine höhere
Silanolaktivität im Vergleich zu alkylgebundenen Phasen der neueren Generation. Für diese
und anderen Gründen wird dringend empfohlen, neue Methoden zu entwickeln
sollte mit Siliziumdioxid der neueren Generation mit höherem Reinheitsgrad durchgeführt werden.
Hochreine Base Deaktivierte Phasen
Moderne alkylgebundene Phasen weisen sehr niedrige kumulative Metallionenkonzentrationen innerhalb der Basiskieselsäure auf (<10 ppm), was dazu führt, dass die Anzahl der isolierten Silanolgruppen und damit die Polarität der Kieselsäureoberfläche ebenfalls reduziert wird. In Verbindung mit effektiveren und reproduzierbaren Bindungsprozessen führen diese Umkehrphasenmaterialien der neueren Generation zu einer deutlich verbesserten Chromatographie für die basischeren polaren gelösten Moleküle. Die Verwendung von gebundenen Alkylgruppen, die hydrophile Substituenten enthalten (d. h. polar eingebettet sind), kann diesen Effekt entweder verstärken und/oder eine andere Selektivität bieten.
Optimierung der Selektivität
Abbildung 2 veranschaulicht die Beziehung zwischen der Änderung der Polarität und der Hydrophobie für typische C18-, C8- und C4-Materialien und zeigt, dass die Hydrophobie mit abnehmender Alkylkettenlänge abnimmt. Höhere Ligandendichte und damit
geringere Polarität, wird auch beobachtet, wenn die Länge der Alkylkette verringert wird. Eine Änderung der Alkylkettenlänge kann jedoch die Analysezeit verkürzen, hat aber keinen wesentlichen Einfluss auf die Selektivität. Die Umstellung der Chemie auf eine alternative gebundene Phase ist ein leistungsfähigeres Mittel, um dies zu erreichen.
Ältere Generation "traditionelle" Phasen
Die älteren "traditionellen" C18-Phasen sind hydrophob und haben eine hohe Polarität, da das Siliciumdioxid mit geringerem Reinheitsgrad einen höheren Anteil an sauren Silanolgruppen enthält, auf denen sie basieren. Die Verwendung neuerer hochreiner Kieselsäuren verringert die Silanolaktivität der resultierenden Phasen und verbessert die Reproduzierbarkeit. Die Verwendung einer polaren eingebetteten Funktionalität kann auch zu einem Material mit geringerer Polarität führen. Für basische gelöste Stoffe, die stark mit Oberflächensilanolen wechselwirken, werden im Allgemeinen Phasen mit geringerer Polarität empfohlen. Bei bestimmten Analysen können jedoch die zusätzlichen Wechselwirkungen, die von den Oberflächensilanolen eines "herkömmlichen" C18-Materials bereitgestellt werden, für die Gesamttrennung von Vorteil sein.
Phenyl-Umkehrphasen-Säule
Phenylgebundene Silikaphasen bieten eine alternative Selektivität für Umkehrphasen zu alkylgebundenen Phasen. Sie weisen eine geringere hydrophobe Retention auf als ihre C18-Gegenstücke, mit ähnlichen Retentionseigenschaften wie C8-gebundene Phasen. Stationäre Phenylphasen interagieren mit Verbindungen, die aromatische Gruppen oder ungesättigte Bindungen enthalten, durch π-π-Wechselwirkungen. Bei aromatischen gelösten Stoffen, die ein elektronegatives Atom oder eine elektronegative Gruppe (z. B. F, NO2) enthalten, nimmt das Ausmaß der π-π-Wechselwirkungen mit der Phenylphase zu.
Aufgrund der starren Natur des Phenylrings kann auch die Form des gelösten Stoffes die Selektivität beeinflussen.
Herkömmliche Phenylphasen sind tendenziell weniger stabil als die entsprechenden C8- oder C18-Umkehrphasen. Darüber hinaus verringert die größere sterische Größe der Phenylgruppe die Oberflächenbedeckung, so dass eine größere Anzahl von freiliegenden Silanolstellen verbleibt. Kürzlich eingeführte Phenylphasen weisen eine höhere Stabilität auf. Die Verwendung einer reineren Silicabasis, effektivere und reproduzierbare Bindungsverfahren und die Verfügbarkeit eines sterisch geschützten Phenylsilans tragen alle zu einer größeren Phasenstabilität und einem geringeren Ausbluten der Säule bei.
Herkömmliche Phenylphasen sind über einen Propylspacer an das Siliciumdioxid gebunden. Die Einbindung des längerkettigen Hexylspacers führt zu einer erhöhten hydrophoben Retention und aromatischen Selektivität.
Polar gebundene Silica-Phasen
Polar gebundene Kieselsäurephasen bieten eine alternative Selektivität zu alkylgebundenen Materialien. Im Allgemeinen haben sie eine geringere Hydrophobie, aber eine höhere Polarität. Cyano-, Amino- und Diol-gebundene Phasen können sowohl in normaler als auch in umgekehrter Phase verwendet werden. In der Normalphase kommen sie schneller mit dem Eluenten ins Gleichgewicht als Siliciumdioxid selbst und werden durch Spuren von Wasser nicht deaktiviert.
An Cyanogruppen gebundene Phasen weisen eine einzigartige Selektivität für polare Verbindungen auf und sind für Gradiententrennungen in normalen Phasen besser geeignet als reines Siliciumdioxid. Die funktionelle Cyanogruppe ist ein starker Dipol, der mit anderen Dipolen interagieren oder Dipole auf gelösten Stoffen induzieren kann. Außerdem weisen diese Phasen aufgrund des Alkyl-Linkers eine mäßige Hydrophobie auf.
Amino-gebundene Phasen zeigen eine andere Selektivität als ungebundenes Siliciumdioxid, insbesondere für Aromaten. Aminosäulen werden auch im HILIC-Modus für die Kohlenhydratanalyse und für andere polare Verbindungen verwendet. Ihre schwachen Anionenaustauschereigenschaften können für die Analyse von Anionen und organischen Säuren genutzt werden.
Diolgebundene Phasen sind eine vielseitige Alternative zu ungebundenem Siliciumdioxid für Normalphasentrennungen. Die Hydroxylgruppen bieten eine gute Selektivität ohne übermäßige Retention, da die H-Bindung mit der Diolschicht schwächer ist als bei Silanolen. Einige diolgebundene Phasen sind speziell für HILIC-Anwendungen entwickelt worden. Materialien mit unterschiedlicher Porengröße werden für Größenausschlusstrennungen verwendet.
Biovanix Umkehrphasen-Säulen & Bulks
Haben Sie Probleme mit der Flüssigkeitschromatographie? Kontaktieren Sie uns direkt.
EN 
AR 
FR 
DE 
KO 
RU 
ES 